產(chǎn)品中心 / Products
- 非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)產(chǎn)品
- 真菌毒素檢測(cè)系列
- 獸藥/農(nóng)藥殘留檢測(cè)系列
- 微囊藻毒素檢測(cè)系列
- 重金屬污染檢測(cè)系列
- 過(guò)敏原檢測(cè)系列
- 食源性微生物檢測(cè)系列
- 常用儀器耗材系列
上海雄圖生物科技有限公司
電 話:021-37651195
傳 真:021-37651196
銀行賬號(hào):03801390040019481
開戶銀行:農(nóng)行上海市松江新城區(qū)支行
郵 箱:xtswsh@163.com
網(wǎng) 址:umhjt.com.cn
地 址:上海市松江區(qū)廣富林路
???????????????697弄21號(hào)昂立大廈13樓
酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的不同檢測(cè)方法
ELISA可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體。該法適于測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿及組織液中的樣本,干擾小可以測(cè)到每毫升納克水平的細(xì)胞因子(或受體)的水平。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑:①固相的抗原或抗體,②酶標(biāo)記的抗原或抗體,③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件,可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。
雙抗體夾心法
雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原常用的方法,操作步驟如下:
1. 將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2. 用脫脂奶粉或BSA進(jìn)行封閉。洗滌除去多余的脫脂奶粉或BSA。
3. 加受檢標(biāo)本:使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間,讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
4. 加酶標(biāo)抗體:使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
5. 加底物:夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物,即可用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。
雙位點(diǎn)一步法
在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí),如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體,則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作,縮短了反應(yīng)時(shí)間,如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體,測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測(cè)定中,應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hookeffect),類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí),過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成夾心復(fù)合物,所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
間接法測(cè)抗體
間接法是檢測(cè)抗體常用的方法,其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:
1. 將特異性抗原與固相載體連接,形成固相抗原:洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
2. 加稀釋的受檢血清:其中的特異抗體與抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合,在洗滌過(guò)程中被洗去。
3. 加酶標(biāo)抗抗體:與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合,從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測(cè)人對(duì)某種疾病的抗體,可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。
4. 加底物顯色:顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。
本法只要替換不同的固相抗原,可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。
競(jìng)爭(zhēng)法
競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例,受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合,因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下:
1. 將特異抗體與固相載體連接,形成固相抗體。洗滌。
2. 待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液,使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原,則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原,則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì),使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原,保溫后,酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)充分的量。洗滌。
3. 加底物顯色:參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原多,故顏色深。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差,代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測(cè)管顏色越淡,表示標(biāo)本中抗原含量越多。
捕獲法測(cè)IgM抗體
血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在,后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM。操作步驟如下:
1. 將抗人IgM抗體連接在固相載體上,形成固相抗人IgM。洗滌。
2. 加入稀釋的血清標(biāo)本:保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
3. 加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。
4. 加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體:使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。
5. 加底物顯色:如有顏色顯示,則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在,是為陽(yáng)性反應(yīng)。
雙抗體夾心法
雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原常用的方法,操作步驟如下:
1. 將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2. 用脫脂奶粉或BSA進(jìn)行封閉。洗滌除去多余的脫脂奶粉或BSA。
3. 加受檢標(biāo)本:使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間,讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
4. 加酶標(biāo)抗體:使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
5. 加底物:夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物,即可用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。
雙位點(diǎn)一步法
在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí),如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體,則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作,縮短了反應(yīng)時(shí)間,如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體,測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測(cè)定中,應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hookeffect),類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí),過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成夾心復(fù)合物,所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
間接法測(cè)抗體
間接法是檢測(cè)抗體常用的方法,其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:
1. 將特異性抗原與固相載體連接,形成固相抗原:洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
2. 加稀釋的受檢血清:其中的特異抗體與抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合,在洗滌過(guò)程中被洗去。
3. 加酶標(biāo)抗抗體:與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合,從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測(cè)人對(duì)某種疾病的抗體,可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。
4. 加底物顯色:顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。
本法只要替換不同的固相抗原,可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。
競(jìng)爭(zhēng)法
競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例,受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合,因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下:
1. 將特異抗體與固相載體連接,形成固相抗體。洗滌。
2. 待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液,使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原,則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原,則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì),使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原,保溫后,酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)充分的量。洗滌。
3. 加底物顯色:參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原多,故顏色深。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差,代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測(cè)管顏色越淡,表示標(biāo)本中抗原含量越多。
捕獲法測(cè)IgM抗體
血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在,后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM。操作步驟如下:
1. 將抗人IgM抗體連接在固相載體上,形成固相抗人IgM。洗滌。
2. 加入稀釋的血清標(biāo)本:保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
3. 加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。
4. 加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體:使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。
5. 加底物顯色:如有顏色顯示,則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在,是為陽(yáng)性反應(yīng)。